Adeno-assoziierter Virus (AAV)

  • Infektion von teilenden und nicht-teilenden Zellen
  • mehrere Serotypen mit unterschiedlichen Tropismen
  • lang anhaltende Transgen Expression, nicht Genom integrierend
  • 4,7 kb DNA-Aufnahmekapazität
  • ssDNA-Genom
  • 20-25 nm Capsidgröße
  • Sicherheitsstufe S1 für rekombinante Viren

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AAV-Vektoren- und AAV-Partikel-Produktion

Für die Generierung von adeno-assoziierten viralen Partikeln kann derzeit aus drei Standard-Leer-Vektoren gewählt werde. Alle beinhalten 5'- und 3'-AAV2-ITRs und eine WPRE- bzw. WPRE3-Sequenz zur Steigerung der Expression. Im Basis-AAV-Vektor wird das Transgen durch die Wahl von unterschiedlichen Promotoren exprimiert. Derzeit benutzen wir den CamKII, hSynapsin1, CMV early enhance/chicken ß actin (CAG), Phosphoglyceratkinase (PGK), EF-1-alpha, CMV und einen Leber spezifischen LP1-Promoter.

In einem zweiten Set an AAV-Vektoren nutzen wir LoxP Sequenzen und inverse-orientierte Transgene, um Cre-Rekombinase anhängige Expression der Transgene in z.B. Cre-transgenen Tieren zu ermöglichen. In diesen Systemen können die gleichen Promotoren verwendet werden, wie im ersten Vektor-Typ.

In einem dritten Set an AAV-Vektoren benutzen wir eine Expressionskassette bei der der Promoter (z.B. hSynapsin1) die Expression eines Reporter Proteins (z.B. GFP oder RFP) reguliert. Dieses Reporterprotein ist wiederum über eine 2A-Sequenz mit einer Klonierungssite (MCS) verbunden, in der ein Transgen kloniert werden kann. Diese Konfiguration erlaubt die bicistronische Expression von Reportergen und Transgen durch einen Promoter.

Wir verwenden Helferplasmide, die alle notwendigen adenoviralen Gene zur AAV-Replikation bereitstellen (E2a, E4, VARNA). Um gewebespezifische Expression zu erreichen, können Sie aus verschiedensten AAV-Serotypen wählen. Derzeit können wir die Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, rh10, AAV2retro, AAV9-PHP.B, AAV9-PHP.eB und AAV9-PHP.S herstellen. Die verwendeten Helferplasmide expremieren alle die AAV2-Replicase und die spezifischen Capsid-Proteine für die einzelnen Serotypen.

Die Aufreinigung der AAV-Partikel hängt von dem gewählten Serotyp des produzierten AAVs ab. So können auf Wunsch Heparin-Säulen für AAV2/2-Partikel Aufreinigungen verwendet werden. Iodixanol-Gradientenzentrifugation werden standardmäßig für alle anderen eingesetzt. Wenn gewünscht können HPLC-Aufreinigungen für AAV2/8 in Kooperation mit der AG Weger, Institut für Virologie der Charité, durchgeführt werden.

Für die Serotypen 9, AAV9-PHP.B, AAV9-PHP.eB, AAV9-PHP.S und rh10 müssen Charité externe Nutzer einen spezifische MTAs für die Helferplasmide mit Penn Vector Core besitzen. Nähere Erklärungen dazu erhält der Nutzer während des Ordering-Prozesses.

Kosten AAV-Produktion

Leistung Kosten Beschreibung
Regular-scale-AAV-Produktion 550 € Charité-intern / 1000 € Charité-extern Aufreinigung der Partikel durch Heparin-Säulen, HPLC oder Iodixanol-Gradienten Zentrifugation, Maßstab ca. 0,5-1 ml, ca. 10^10-13 Partikel / ml
Large-scale-AAV-Produktion 880 € Charité-intern / 1500 € Charité-extern Aufreinigung der Partikel durch Heparin-Säulen, HPLC oder Iodixanol-Gradienten Zentrifugation, Maßstab ca. 1-2 ml, ca. 10^10-13 Partikel / ml
AAVs für in-vitro-Anwendungen 250 € Charité-intern / 400 € Charité-extern HEK-Zelllysate. Keine Aufreinigung. Maßstab ca. 0.5-1 ml, ca. 10^9-12 Partikel / ml
     
AAV-Partikel "ready-made" 130 € AAV-Partikel aus unserem Stock für Anwendungen im kleinen Maßstab und Pilotexperimente. Maßstab 0,1 ml ca. 10^10-13 Partikel / ml (Verfügbarkeit bitte dem Katalog entnehmen)
Dialyse / Pufferaustausch nach der AAV-Produktion 55 € Dialyse mit "Slide-A-Lyser" oder Pufferaustausch mittels Amicon Filters