Semliki-Forest-Viren

Semliki-Forest-Viren (SFV) gehören zur Familie der Togoviridae, Genus Alphavirus. Sie verfügen über ein ikosaedrisches Nukleokapsid, welches von einer Lipid-Membran mit viralen Hüllproteinen umgeben ist. Das Genom des SFV ist eine einzelsträngige RNA positiver Polarität. Sie weisst am 5' Ende eine CAP Struktur auf und ist am 3' Ende polyadenyliert. Die RNA enthält zwei Leserahmen, einen für die Replikationsproteine und einen für die Strukturproteine. Das Verpackungssignal Psi liegt innerhalb des Leserahmens der Replikationsgene und ein subgenomischer Promoter liegt zwischen Replikase- und Strukturgenen.

Wir nutzen zwei Vektoren zur Produktion von SFV viralen Partikeln. In dem ersten Vektor pSFV-1 sind die Strukturproteine durch das Transgen ersetzt worden. Die Strukturproteine enthält der zweite Vektor pSFV-Helper. Rekombinante RNA von pSFV-1 kann sich somit zwar replizieren, aber es werden keine neuen viralen Partikel gebildet. Dies kann nur in Anwesenheit der viralen Strukturproteine durch pSFV-Helper geschehen.

Beide Vektoren beinhalten einen SP6 Promoter und eine einzelne Restriktionsschnittstelle (SpeI) am 3' Ende des Leserahmens zur Bildung einzelsträngiger RNA durch in-vitro Transkription. Aufgereinigte RNA wird anschließend in BHK-21 Zellen durch Elektroporation transfiziert. Um die Entstehung infektiöser und replikationskompetenter Virus Partikel zu vermeiden (Rekombinationen zwischen den Vektor RNAs ist möglich), wurde die proteolytische Spaltstelle zwischen zwei Strukturproteinen im pSFV-Helper mutiert, so dass zunächst nicht-infektiöse Partikel generiert werden. Nur durch die anschließende Behandlung mit alpha-Chymotrypsin werden die viralen Vektorpartikel in einen infektiösen Zustand überführt. Die so gewonnenen Partikel unterliegen der gentechnischen Sicherheitsstufe S1.